Notas Técnicas

Análisis de Proteínas por el método Dumas por combustión

El análisis cuantitativo de nitrógeno y de proteínas crudas juega un rol muy importante, en particular para la evaluación de productos agrícolas. A diferencia de otras determinaciones de elementos que hoy se efectúan por medios espectroscópicos tales como Absorción Atómica o ICP, todavía se utiliza ampliamente el tradicional método Kjeldahl de química húmeda para el importante análisis de nitrógeno. Pero, desde hace algunos años, tiene cada vez más éxito el rápido, preciso y totalmente automático método Dumas por combustión.

Heraeus, en Hanau, Alemania y su sucesor directo para la instrumentación analítica ELEMENTAR Analysensysteme GmbH, desarrollaron en 1989 el primer analizador Dumas por combustión para macro muestras en el rango de gramos, y tendieron las bases para este desarrollo. Basado en este invento pionero al que siguió un desarrollo sostenido, hemos compilado las preguntas más frecuentes y sus respuestas para una mejor comprensión . El tema principal es la introducción al método y la primera evaluación de la aplicación a muestras típicas. 

Las Preguntas Más Frecuentes

¿Qué o quién es Dumas?
Jean Baptiste Dumas fue un químico y político francés (1800-1884). Desarrolló un método para determinar nitrógeno mezclando y calentando la sustancia a ser analizada con óxido de cobre en una atmósfera de dióxido de carbono. Los gases formados son reducidos en el cobre y se determina el nitrógeno molecular por medición volumétrica.

¿Y por qué el método de Combustión?
Para la determinación de nitrógeno por el método de Dumas modificado, la muestra es calentada a alrededor de 1000° C en atmósfera de oxígeno. El nitrógeno de los compuestos (aminoácidos) será convertido a óxido de nitrógeno y nitrógeno molecular. Luego de la post oxidación catalítica, secado y limpieza del gas carrier, todos los óxidos de nitrógeno son reducidos a nitrógeno molecular en el agente reductor (cobre o tungsteno) y transportado por el gas carrier a la celda de conductividad (TCD) para la determinación cuantitativa. La computadora calcula automáticamente el porcentaje de nitrógeno o, por medio de un factor de conversión empírico, el contenido de proteína cruda (considerando el peso de la muestra).

¿Es un método desarrollado recientemente comparado con el Kjeldahl?
El método Dumas (1833) es más antiguo que el tradicional método Kjeldahl. Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl, un científico danés, describió en 1883 el método de digestión de la muestra con ácido sulfúrico caliente y concentrado seguido por una destilación por vapor de agua y la titulación del amoníaco formado.

¿Por qué su uso se difundió solo recientemente?
En los viejos tiempos, la cantidad de muestra del método Dumas era solo de unos pocos miligramos. Consecuentemente, la aplicación práctica para productos agrícolas era algo muy limitada. En el análisis químico orgánico el método está bien establecido desde hace décadas. En 1989, la Heraeus Analytical Division en Hanau, Alemania, predecesora de ELEMENTAR Analysensysteme, desarrolló el primer analizador por combustión en el rango de gramos. Ese fue el comienzo del desarrollo del método Dumas en los procedimientos instrumentales estándar, también para la determinación de proteínas en alimentos y forraje, material de plantas y suelos.

¿Cuales son las ventajas comparadas con el método Kjeldahl?
El método Kjeldahl comienza con una digestión de la muestra con ácido sulfúrico caliente y concentrado por un lapso de 1 a 2 horas. Históricamente, para completar la digestión se agregaban catalizadores como mercurio o selenio. Debido a los problemas de disposición de contaminantes como el mercurio y selenio, se utilizan catalizadores menos eficientes tales como el titanio y el cobre. Después de la digestión se agrega una base concentrada y el amoníaco es destilado con vapor de agua, absorbido en ácido estándar y titulado con base. Comparado con este procedimiento, las ventajas del método Dumas son claras:

• Seguridad: Una de las grandes ventajas del método Dumas es que le permite a Ud. eliminar la necesidad de exponer a su personal al manipuleo de ácido sulfúrico y base concentrado, y el monitoreo de ácido hirviendo en recipientes de vidrio que con frecuencia se rompen durante el análisis o la transferencia.
• No Necesita Productos Químicos Para La Digestión: Dumas requiere agentes reductores no agresivos ni venenosos como cobre u óxido de cobre y tungsteno así como gases como helio o CO2 y una cierta cantidad de oxígeno. No hay peligro en su manipulación, ni hay una costosa disposición de residuos contaminantes.
• Significativos Ahorros De Tiempo: Desde que llega la muestra hasta la impresión de los resultados analíticos, un analizador Dumas moderno solo requiere unos pocos minutos. Para Kjeldahl Ud. tendrá que esperar horas.
• Bajos Requerimientos De Instalación: Un analizador DUMAS de Elementar solo requiere 1 metro de espacio de mesada de su laboratorio, una fuente de energía eléctrica, así como dos gases no peligrosos. No requiere de sistema de extracción de gases corrosivos, ni de costoso espacio para los blocks de digestión, ni de espacio para almacenar productos químicos y sus desechos, ni siquiera se necesita una fuente de agua.
• Completa Automatización: Luego de pesar 39 muestras o más, y llenar el carrousel de muestras, el análisis es totalmente automático y sin atención, aún durante las horas de la noche. A la mañana siguiente tiene Ud. disponible el protocolo analítico de todas las muestras. No hay que rellenar, recargar ni limpiar los viales de digestión para cada muestra.
• Bajo Costo por Análisis: Los ahorros en tiempo de análisis, productos químicos, equipamiento de laboratorio, requerimientos de instalación y la disposición final de los residuos, agregarán una ventaja de costos significativa, particularmente cuando se lo compara con el costo del Kjeldahl.
• Resultados Analíticos Exactos: El método Dumas con un instrumento Elementar provee el 100% de recuperación del nitrógeno independientemente de su composición química (la única excepción: algunos nitruros). Los resultados del Kjeldahl dependen mucho del compuesto a ser analizado o del catalizador utilizado para la digestión, por Ej. algunos compuestos heterocíclicos, nitratos, nitrosos, compuestos nitro- y azo no son digeridos o no lo son completamente.

Los costos de inversión, ¿no son relativamente elevados?
Un sistema Dumas completo y totalmente automático no es más costoso que un analizador Kjeldahl semi-automático. Teniendo en cuenta el costo de los bloques de digestión, campanas de extracción, stock de productos químicos y la disposición de residuos que deben ser agregados al instrumento Kjeldahl para una productividad elevada, el analizador Dumas cuesta aún menos.

¿Pero los ácidos y bases no son un factor de bajo costo para el Kjeldahl?
Lo importante es el cálculo total del sistema completo requerido, la mano de obra, la disposición de residuos, las medidas de seguridad para el manipuleo del ácido sulfúrico concentrado y caliente, el reemplazo de digestores de vidrio rotos, la renovación frecuente de las campanas de extracción y... lo que conduce a gastos muy superiores para el análisis Kjeldahl comparado con el Dumas.

¿Pero no es hoy el Kjeldahl el método estándar oficial?
Esto fue cierto en el pasado. Debido a las obvias ventajas del método Dumas, un desarrollo mundial condujo al resultado que el método Dumas también es un procedimiento estándar aceptado. En USA y Canadá este proceso está casi completado (AOAC, AOCS, AACC, etc.), en Alemania existen estándares DIN para leche y productos lácteos o suelos, así como existen métodos estándar para cervecerías, fertilizantes y otros (MEBAK o LUFA). También está en preparación un método estándar ISO para granos y cereales y... Y donde Kjeldahl es todavía el método oficialmente exigido, la rutina diaria ya se está haciendo con Dumas. Esto ahorra tiempo y dinero.

¿Pero, no se supone que el Dumas es para laboratorios con gran cantidad de muestras?
Si solo se tiene que analizar unas pocas muestras por mes, difícilmente se pueda justificar un sistema totalmente automático. Pero con 5-10 análisis por día y pensar en Dumas en el plan de inversión. Aún más si se requieren unos pocos análisis, pero instantáneos, no hay alternativa a Dumas. El elevado confort operativo y la disponibilidad del resultado del análisis en minutos hacen que el instrumento sea adecuado para el control de calidad de procesos. Esto genera nuevas tareas analíticas que no se podían usar con la vieja y lenta técnica Kjeldahl . Uno debería pensar en las tareas del mañana. Es importante para una decisión, por supuesto que Dumas sea el método estándar del futuro lo que puede ahorrar mucho dinero en la operación.

¿Pero, no requiere también el Dumas químicos tóxicos?
Para mediciones de precisión de muestras con alto contenido de azufre, un “scrubber” de cromato de plomo era particularmente eficiente. Con la introducción del método de reducción de tungsteno de Elementar (patente en trámite), ya no se requiere un absorbedor adicional de azufre.

¿Pero también los instrumentos Dumas requieren mantenimiento?
Correcto –También la digestión a altas temperaturas puede causar corrosión del material, puede haber pérdidas, y consumibles como el óxido de cobre o cobre y tungsteno reductor, deben ser reemplazados o regenerados. Algunos analizadores Dumas requieren actividades de mantenimiento relativamente frecuentes. Un instrumento moderno como el nuevo Rapid N III de Elementar corre muestras 24 horas por día con un breve chek de rutina. Los bajos requerimientos de mantenimiento son un parámetro de la calidad de los instrumentos de alta performance de hoy en día. El cambio frecuente de filtros de polvo,  O-rings, lavadores de agua (scrubbers), etc. ya no son estado del arte.

¿Los resultados analíticos de Dumas y Kjeldahl, son en realidad comparables?
Antes que nada, debe quedar claro que el método Dumas de digestión a altas temperaturas sirve para un 100% de recuperación de nitrógeno total. La digestión Kjeldahl en cambio puede ser dependiente de la sustancia y puede conducir a resultados bajos. Para productos agrícolas, extensivos ensayos cruzados (ring trials) han demostrado que dan normalmente una buena comparación de resultados entre Kjeldahl y Dumas. Valores Kjeldahl ligeramente bajos pueden ser convertidos a valores Dumas verdaderos mediante un factor de correlación. Si se requiere el valor Kjeldahl, el instrumento Dumas puede ser fácilmente calibrado con el estándar interno N/ proteína que es analizado por el Kjeldahl.

¿Es realmente representativo el peso de la muestra?
Los instrumentos modernos pueden analizar hasta varios gramos de muestra. 1 g de muestra con contenido orgánico debería ser medido con un buen instrumento, si bien muchas muestras requerirán solo unos pocos cientos de miligramos.
Si las muestras son muy heterogéneas, de todos modos deberán ser molidas y mezcladas dado que ni siquiera un peso de 10 g asegurará un valor analítico preciso. La elevada velocidad de análisis también permitirá la repetición de mediciones.

¿No es también una buena alternativa un espectrómetro NIR?
Los instrumentos NIR y Dumas son complementarios y no compiten uno con el otro. El método NIR es un método indirecto. La exactitud depende en gran medida del tipo de muestra y de la correcta calibración con los estándares, los que deben ser muy similares a los de la muestras a ser analizadas. En cambio, el método Dumas es un método casi absoluto que puede medir diferentes tipos de muestras con la misma y única curva de calibración (calibrada con sustancias químicas puras) con un elevado grado de precisión. Para la medición de muestras homogéneas y conocidas con moderados requisitos de exactitud, hay buenas y sencillas aplicaciones NIR, pero requieren de muchas y costosas calibraciones. Los estándares de calibración pueden ser medidos con el analizador Dumas. Para mezclas o sustancias naturales desconocidas, solo Dumas puede ser el método de elección.

¿Pero la sensibilidad de detección es limitada?
Antes que nada, la tarea para casi todas las muestras típicas es el análisis cuantitativo preciso en el rango de 0.01% hasta el N 100% teórico pero no el análisis de trazas en el rango de ppm. Esta es la característica principal del método con su calibración libre de matrices, la estabilidad a largo plazo y el amplio rango de medición de su detector de conductividad térmica. Para la determinación de trazas la detección por Quimiluminisencia (CLD) del NO es adecuada pero no es aplicable para el rango de concentración de una muestra típica de productos agrícolas. Para el rango bajo 50 ppm ELEMENTAR puede suministrar el analizador Dumas Vario TRACE N, que tiene la ventaja de una sencilla calibración y libre de matrices comparado con los instrumentos CLD.

¿Existen limitaciones en lo que respecta al tipo de muestras?
Las muestras pueden ser medidas en forma sólida o líquida. No se requieren químicos u otras formas de pre-tratamiento. Con suficiente homogeneidad, por Ej. una muestra sólida será prensada como pellet y puesta en el cambiador de muestras. Dependiendo del tipo de muestra, también puede ser envuelta en papel, cápsulas de gel, o en láminas de estaño. Los líquidos son sellados en cápsulas de estaño. Otra técnica de alimentar las muestras es colocarlas (sólidas o líquidas) en crisoles re-usables, los que son enviados automáticamente hacia la zona de combustión. Después del análisis las cenizas minerales sobrantes son removidas del horno. En cualquier caso lo importante es que es posible el análisis directo de la muestra original sin extensos pre-tratamientos, calibraciones, diluciones, etc. Esto es válido para prácticamente todas las muestras, excepto para nitruros metálicos refractarios. El tubo de combustión de acero inoxidable es más resistente contra muestras agresivas, por Ej. con alto contenido de sales, e irrompible comparado con los tubos de cuarzo.

¿Qué es importante cuando se selecciona un instrumento?
Cada instrumento debe – por supuesto – cumplir con requisitos generales tales como la exactitud y precisión, facilidad de operación, confiabilidad, bajos costos operativos, peso de muestra suficiente y componentes de larga vida. También es importante que el instrumento esté configurado para la aplicación individual y posea una óptima relación precio/ performance. Un fabricante como ELEMENTAR puede proveer una gama completa de instrumentos – debido a las tareas de análisis (muestras sólidas o líquidas, concentraciones, contenido de minerales, homogeneidad, número de muestras, manipuleo de la muestra, etc.). A demás, es importante si, además del nitrógeno, también son requeridos elementos como el carbono, hidrógeno o azufre. Es bueno pedir el consejo de los expertos de ELEMENTAR, o, puede enviar sus muestras para efectuar ensayos en nuestro laboratorio de aplicación. Entonces estará en condiciones de efectuar una elección correcta.

¿Qué condiciones son requeridas para su instalación y operación?
Solamente se requiere 220V/ 50Hz , gas carrier (CO2 o Helio) y oxígeno para correr el instrumento. Para buenos resultados analíticos la pureza de los gases deberá ser 99,995%. El ambiente para la instalación no debe reunir condiciones especiales, tampoco se requiere una campana extractora. 1 m lineal de mesada es suficiente para la instalación. Un sistema en condiciones operativas completas requiere una PC con impresora y una balanza al 0.1 mg que con frecuencia ya existe en el sitio.

¿Qué hay de medidas especiales de seguridad?
Los buenos instrumentos no necesitan medidas especiales de seguridad y pueden funcionar toda la noche sin supervisión. Tampoco fallas como cortes de energía eléctrica conllevan daños al instrumento. Lo mismo se aplica a seguridad eléctrica. Aún al horno se le aplica baja tensión. Por supuesto el sistema cumple con las normas de seguridad CE y otras normas internacionales. Solamente cuando se abre el instrumento se debe tener en cuenta que podría haber partes calientes.

¿Qué calificaciones debe reunir el operador?
El instrumento está diseñado para ser operado en rutina por personal semi-calificado. El proceso analítico es simple y no requiere habilidades químicas. La PC para la operación del equipo corre bajo MS-Windows y tampoco requiere conocimientos especiales de software. Para las actividades de mantenimiento simple como el reemplazo de un tubo de combustión no se requieren habilidades mecánicas especiales. Para la operación estándar, los operadores entrenados no requieren el soporte de fábrica. Una vez al año se recomienda el mantenimiento de rutina por parte de una persona de servicio calificada, pero puede ser efectuado por el mismo usuario/ a luego de un entrenamiento adecuado.

¿Y qué hay sobre calibraciones frecuentes?
La característica de un buen instrumento es la extensa estabilidad a largo plazo. La calibración básica efectuada en fábrica es estable por muchos meses, y aún años, y aplicable a todo tipo de muestras. En la rutina diaria, solo 2 o 3 mediciones de estándar sirven para la adaptación a las condiciones diarias, como la presión atmosférica (factor diario). No se requiere calibración luego de una tarea de mantenimiento como el reemplazo de un tubo de combustión. Un buen instrumento tampoco exige correr blancos con frecuencia. Esto permite por ejemplo, correr 79 muestras de distintos tipos, aún durante la noche, sin atención.

¿Qué de las influencias ambientales?
Como ya se ha mencionado, no se necesitan condiciones ambientales específicas, como aire acondicionado, campana extractora o ausencia de polvo. Las pequeñas desviaciones de la presión atmosférica son automáticamente compensadas por el factor diario. Como en todo instrumento de medición, se debe evitar la exposición directa a la luz solar.

¿No es una ventaja analizar solamente una parte de los gases de combustión?
El así llamado “gas splitting”, (o alícutota del gas producto de la combustión) sirve para extender la vida operativa del cobre reductor. Con el uso del tungsteno en vez del cobre (patente en trámite por ELEMENTAR), se hizo posible un incremento en la cantidad de análisis por un factor de 4 por tubo de reducción manteniendo el análisis completo de todos los gases de la combustión. El análisis del total de los gases posee la ventaja que todo el proceso de combustión es observado “on-line” hasta que la combustión ha finalizado. En el caso de una combustión lenta, el tiempo de análisis es extendido automáticamente. Esta es una protección contra errores de medición debido a una interrupción temprana de la combustión. Uno debe tener in mente que un analizador tipo “gas splitting” que recibe de 10 a 20 veces más oxígeno por muestra, es una fuente potencial de problemas mecánicos que requiere mantenimiento adicional.

¿No se requiere un gran exceso de oxígeno para completar la combustión?
Las sustancias de combustión lenta necesitan un mínimo de tiempo de combustión independientemente de la provisión de oxígeno. Es mejor controlar la cantidad realmente necesaria de modo automático por medio de un sensor y también optimizar automáticamente el tiempo de combustión. Esto lleva a una combustión total y ahorra el costoso oxígeno de alta pureza.

¿Cuáles son las ventajas de la combustión horizontal o vertical?
Lo importante son los buenos resultados analíticos que pueden ser obtenidos con ambos principios. Al comienzo del análisis elemental, el instrumento tenía tubos de combustión horizontales. Con el incremento en la automaticidad de los instrumentos, se impuso la posición vertical de los tubos, lo que también redundó en instrumentos más compactos.

¿Los parámetros de los instrumentos, se aplican a todos los tipos de muestras?
Para llegar a los menores costos por análisis y la mejor exactitud posible, se deben optimizar los parámetros de operación. Un buen instrumento permitirá el análisis de toda una familia de sustancias como productos de granos y cereales con un solo y mismo set de parámetros.

Una empresa con una amplia experiencia en el análisis por combustión – como ELEMENTAR – provee un paquete completo e integrado de material de aplicaciones, conocimiento de aplicaciones comparables y un laboratorio de aplicaciones que es capaz de resolver sus problemas específicos, aún para muestras inusuales o problemáticasn correcta.

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